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粪便RNA提取试剂盒中文说明书

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PowerMicrobiome RNA Isolation Kit

粪便RNA提取试剂盒

货号

提取次数

26000-50

50

 

简介

PowerMicrobiome RNA Isolation Kit设计用于简便快速提取粪便、肠内容物、干粪、口腔棉拭子、分泌物等富含PCR抑制因子样本总RNA。专利IRT技术(Inhibitor Removal Technology®)能完全去除这些样本中含有的PCR抑制物,如未完全消化的植物成分、裂解红细胞的亚铁血红素等。试剂盒含DNase I及相应试剂,可去除可能污染的基因组DNA。最终RNA洗脱浓缩在RNade-Free Water中,可直接用于cDNA synthesisRT-qPCR等下游实验。

 

操作预览

建议粪便或生物固体加样0.25g。粪便采样后尽快-80℃保存,以保护RNA完整性。

化学裂解缓冲液与0.1mm玻璃研磨珠,共同作用充分裂解微生物细胞。绑定液(PM3)把RNA吸附到离心柱滤膜上,DNase消化残余的基因组DNA后,冲洗并洗脱到RNase-free Water中,最终RNA可直接用于RT-qPCR等下游实验。

若实验要求RNA需要再一步DNase处理,建议使用DNase Max™ Kit(货号:15200-50),一种全新的室温稳定保存的DNase完全去除基因组DNA。只需20min即可消化掉30μg DNA,无需加热或EDTA干涉,采用特制的树脂能轻易去除DNase酶。使用DNase Max™ Kit处理完以后,RNA仍能保持原有的高质量。

 

 

相关产品

货号

数量

DNase Max™ Kit

15200-50

50

Vortex Adapter, holds 24 (1.5-2.0 ml) tubes

13000-V1-24

1 unit

 

样本储存与保护

从粪便微生物中提取的RNA的得率和完整性很大程度上受个体消化系统功能、特定饮食菜单以及收集样本到-80℃保存耗时长短影响。粪便主要成分是水(65-85%)、未完全消化食物、胆汁、胆红素(由死亡红细胞衍生)和死亡细菌(可达50%)等。因为存在大量的死亡或濒死细菌及人体细胞,从粪便中提取的RNA用标准分析方法鉴定能看到一定成都的降解。QPCR检测从粪便或肠内容物提取的RNA应注意设计检测小片段RNA,以提高检测的灵敏度。

为了提供粪便RNA的质量,最好采集后尽快处理。可分装后-80℃冷冻,避免大块样本反复冻融。从冰箱中取出的样本,完全溶解前就可以加入含βMEPM2裂解缓冲液到Bead Tube中。马上加样开始研磨以促使保护液能充分浸泡到细胞RNA。新鲜采集未经冷冻的样品,也应该立即加入裂解缓冲液进行研磨,以获得最好质量的RNA

 

设备要求:

微型离心机(13000g

Vortex-Genie®2 涡旋仪(MO BIO货号#13111-V-220

涡旋仪适配器(MO BIO货号#13000-V1-24

自备试剂:

β巯基乙醇

 

选用试剂:

苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1 pH6.7-8.0Amresco 货号:0883-100,0883-400

 

试剂盒组分

 

货号:26000-50

组分

Glass Bead Tubes, 0.1mm

50

Solution PM1

36 ml

Solution PM2

11 ml

Solution PM3

36 ml

Solution PM4

3×24 ml

Solution PM5

3×24 ml

Solution PM6

2.5 ml

Solution PM7

23 ml

Solution PM8

5.5ml

DNase I RNase-Free, 15000units

1  vial

Spin Filters

50

2 ml Collection Tubes

200

△实验前请先逐一检查试剂!

 

保存

DNase I 4℃保存,重悬分装后-20℃保存。其它组分室温(15-30℃)保存。

实验开始前注意事项

PM1使用前必须55-60℃水浴至完全没有沉淀,可趁热使用。PM5使用前摇匀。

 

β巯基乙醇加入到PM1,制备PM1/βME溶液

把β巯基乙醇(βME)加入到PM1溶液中,使最终浓度达到10μ/mlPM1/μME溶液随着时间推移会失效,最好现配现用,保存时间不要超过一个月。每次提取需要650μl PM1/βME溶液。也可以直接把650μl PM1溶液和6.5μl βME加入到玻璃珠研磨管中。

    注意:处理βME时请在通风橱中进行。

 

制备DNase I

A. 300μl RNase-FreeWaterPM8溶液)加入到DNase IRNase-Free)冻干粉中,轻摇混匀。以50μl分装,-20℃保存。

        注意:DNase I不能反复冻融超过3遍。

B. 在实验前制备DNase I溶液,化冻足够量的DNase I,每次提取需要5μl一地步稀释保存的 DNase I45μlPM6

如:

样品数量

稀释保存的DNase I

PM6溶液

1

5μl

45μl

2

10μl

90μl

10

50μl

450μl

 

操作步骤:

1. 加入0.25g粪便或生物固体(biosoild)到Glass Bead Tube0.1mm中。

    注意:若希望用苯酚裂解法,加样后可加入500μl 苯酚/氯仿/异戊醇 pH6.5-8.0Bead Tube中。

2. 加入650μl PM1/βME(见前文制备步骤)到Glass Bead Tube,0.1mm中。或直接加入650μl PM16.5μlGlass Bead Tube中。

3. Glass Bead Tube,0.1mm固定在MOBIO 涡旋仪适配器上(货号13000-V113000-V1-24)。Tube管螺帽调整,朝适配器中心方向。

4. 最大转速连续涡旋振荡10min

这一步发生了什么:化学裂解液和珠磨研磨同时裂解破碎细胞。裂解液还能保护释放到上清液中的RNA

5. 室温13000g离心1min。把上清转移到一个干净的2ml收集管中(试剂盒提供)。约可获得500-600μl上清。若加入的是把苯酚/氯仿/异戊醇,把上分离层转移到一个干净的2ml收集管中。

这一步发生了什么:蛋白、细胞碎片与研磨珠一起沉淀下来,上清中含有人和细菌RNADNA

6. 加入150μl PM2溶液,稍微涡旋混匀。4℃孵育5min

这一步发生了什么:PM2溶液为抑制因子去除溶液,作为IRT技术一部分可完全去除样品很重含有的抑制下游PCR及其它应用的抑制因子。

7. 13000g离心1min

8. 避开底部沉淀,转移不多于650μl上清到一个干净的2ml收集管中(试剂盒提供)。

9. 加入650μl PM3溶液650μl PM4溶液,稍微涡旋混匀。

      注意:为了防止小片段RNA5StRNA及降解的RNA)与正常的mRNArRNA共同洗脱下来,可用650μl 100%乙醇代替PM4溶液。

      若为了同时洗脱如mciroRNAsiRNA等小片段RNA,可把裂解物转移到一个可至少能容纳2.6mlTube中,加入650μl 100%乙醇。这部分100% 乙醇需要自备。

这一步发生了什么:PM3为绑定盐溶液,可辅助提取总核酸,PM4溶液为100%乙醇。这些溶液为把RNADNA绑定到Spin Filter上创造化学条件。

10. 加载650μl 上清到Spin Filter上,13000g离心1min,弃去滤液。重复步骤直至过滤完所有上清。

      注意:一般共需要加载三次上清。若为了提高microRNAsiRNA而额外添加了100%乙醇,可能共需要加载四次。

11. 使用前先摇匀PM5。加入650μl PM5溶液13000g离心1min

这一步发生了什么:PM5为含异丙醇的冲洗缓冲液,可去除滤膜上残留的盐溶液,为DNase处理创造条件。

12. 弃去滤液,13000g再离心1min,以进一步去除残留的洗液。

13. Spin Filter放到一个干净的2ml 收集管中(试剂盒提供)。

      注意:若你想同时提取RNADNA,请忽略步骤14-16

14. 加入50μl DNase 溶液(每个提取需要混匀45μl PM6溶液和5μl DNase I稀释液,详见上文DNase溶液的制备)。

15. 室温孵育15min

这一步发生了什么:PM6溶液为DNase消化缓冲液,DNase浸润整个滤膜,消化其中的基因组DNA

16. 加入400μl PM7溶液13000g离心1min

这一步发生了什么:PM7溶液可灭活DNase,并把降解的DNA冲洗下来。

17. 弃去滤液,加入650μl PM5溶液,13000g离心1min

18. 弃去滤液,加入650μl PM4溶液,13000g离心1min

这一步发生了什么:PM5PM4为含异戊醇和酒精的冲洗缓冲液,洗脱RNA前分别出去离心柱上残留的盐分。

19. 弃去滤液,13000g离心2min,进一步去除残留的冲洗液。

这一步发生了什么:再一次离心确保滤膜上残留的乙醇全部去除,确保洗脱顺利进行。

20. Spin Filter放到一个干净的2ml 收集管中(试剂盒提供)。

21. 100μl PM8溶液(RNase-Free Water)加入到离心柱滤膜中间,常温放置至少1min

      注意:使用100μl PM8可获得最大的RNA洗脱得率。为了获得更浓缩的RNAPM8用量也不能少于50μlPM8用量不能低于50μl

22. 13000g离心1min

这一步发生了什么:RNA从滤膜上洗脱下来,进入到PM8RNase-Free Water)中。此时RNA可直接用于下游酶实验。

23. 弃去Spin Filter

    此时RNA可直接用于下游实验。装有RNATube管可-80℃保存。

 

疑点难点

RNA降解

粪便样本最好的保存办法是-80℃冷冻保存,避免反复冻融。粪便固形物成分主要是含大量降解RNA的死亡的细菌,提取到完整RNA的同时抽提出大量小片段RNA是正常的。

为了减少小片段降解RNA,可步骤9中降低乙醇的浓度。用650μl 70%乙醇代替PM4.

若用RNALater保存粪便样本,请把加样量减少到0.1g以免堵塞离心柱。RNALater的使用要求对最终提取得到的RNA做进一步基因组DNA消化处理(推荐使用货号15200-50)。

裂解步骤中使用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1pH6.7-8.0可有助于保护RNA完整性。加样前加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇到Glass Bead Tube,0.1mm 中。对于大多数固态样本,水相和有机相分离不明显,而含水量高的样品可能可以看到清洗的分成。总之,取上层溶液进入下一步处理。

 

纯度很低

RNA理想纯度260/280值应为1.8-2.1,260/230值大于1.5。若RNA纯度不够,有可能跟处理的样本类型有关。若260/230读数较低,可增加PM2的用量至200μl以去除更多抑制因子。如果增加PM2用量后,RNA纯度仍不能让人满意,请减少加样量。

 

基因组DNA污染

根据样本中细菌数量情况,经过离心柱DNase消化后仍有可能残留少量基因组DNA。为了完全去除基因组DNA,可使用无需加热或EDTA干预RTS DNase Kit(货号:15200-50),以确保完全去除DNA

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